LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Bioloģiskā aktivitāte

In Vitro

Savvaļas tipa un G2019S transdukcijas rezultātā tiek iegūts 2,5 reizes lielāks TR-FRET signāls, kuru var inhibētLRRK2-IN-1no devas atkarīgā veidā ar IC50 vērtībām attiecīgi 0,08 µM un 0,03 µM [1]. LRRK2-IN-1 bija IC50 45 nM DCLK2 kavēšanai, un tā IC50 bija lielāka par 1 µM, ja to novērtēja AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 un PLK1 bioķīmiskajos testos. Ir apstiprināts, ka LRRK2-IN-1 inhibē MAPK7 ar EC50 160 nM. LRRK2-IN-1 izraisa no devas atkarīgu Ser910 un Ser935 fosforilēšanas kavēšanu, kam pievienots 14-3-3 zaudējums, saistoties gan ar savvaļas tipa LRRK2, gan ar LRRK2 [G2019S], kas stabili transfecētas HEK293 šūnās [2]. LRRK2-IN-1 ir mēreni citotoksisks ar IC50 49,3 µM HepG2 šūnās. LRRK2-IN-1 uzrāda genotoksicitāti S9 klātbūtnē un neesamībā attiecīgi pie 15,6 un 3,9 µM [3]. LRRK2-IN-1 kavē HCT116 un AsPC-1 šūnu apoptozes pazīmes un veicina šūnu nāvi [4].

In Vivo

LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip) inducē LRRK2 defosforilēšanu peļu nierēs [2]. LRRK2-IN-1 (100 mg / kg) peritumorālas injekcijas rezultātā ievērojami samazinās audzēja tilpums un AsPC-1 audzēja ksenogrāfu svars [4].

Kināzes pārbaude

Aktīvā GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) un GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527). ) enzīmu attīra ar glutationa sepharose no HEK293 šūnu lizāta 36 stundas pēc atbilstošu cDNS konstrukciju pārejošas transfekcijas. Peptīdu kināzes testi, kas veikti divos eksemplāros, tiek veikti ar kopējo tilpumu 40 µL, kas satur 0,5 µg LRRK2 kināzes (kas ar aptuveni 10% tīrību dod galīgo koncentrāciju 8 nM) 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 0,1 mM. EGTA, 10 mM MgCl2, 20 µM Nictide, 0,1 µM [γ-32P] ATP (500 cpm / pmol) un norādītās inhibitora koncentrācijas, kas izšķīdinātas DMSO. Pēc 15 minūšu inkubācijas 30 ° C temperatūrā reakcijas tiek pabeigtas, uzsmidzinot 35 µL reakcijas maisījuma uz P81 fosforcelulozes papīra un iegremdējot 50 mM fosforskābē. Paraugus plaši mazgā un [γ-32P] ATP iekļaušanu niktidā kvantitatīvi nosaka, izmantojot Cerenkova skaitīšanu. IC50 vērtības tiek aprēķinātas ar GraphPad Prism, izmantojot nelineāro regresijas analīzi.

Šūnu pārbaude

Šūnas (104 šūnas vienā iedobē) iesēj 96 iedobju audu kultūras plāksnītē trīs eksemplāros. Šūnas kultivē LRRK2-IN-1 klātbūtnē ar DMSO kā nesēju pie 0, 0,31, 0,63, 1, 2 un 5, 10 un 20 μM. 48 stundas pēc apstrādes katrā iedobē pievieno 10 μL TACS MTT reaģenta, un šūnas inkubē 37 ° C, līdz šūnās kļūst redzamas tumšas kristāliskas nogulsnes. Pēc tam iedobēm pievieno 100 μL 266 mM NH4OH DMSO un uz minūti ar nelielu ātrumu uzliek šķīvja kratītājam. Pēc kratīšanas plāksnei ļauj inkubēties 10 minūtes, pasargājot no gaismas, un katras iedobes OD550 nolasa, izmantojot mikroplašu lasītāju. Rezultāti tiek vidināti un aprēķināti procentos no DMSO (transportlīdzekļa) kontroles + / - vidējā standarta kļūda.

Dzīvnieku administrators

LRRK2-IN-1izšķīdina Captisol un ievada ar intraperitoneālu injekciju savvaļas tipa vīriešu dzimuma C57BL / 6 pelēm devā 100 mg / kg. Kontroles pelēm injicē vienādu daudzumu Captisol. Pēc 1 un 2 stundas laika peles izdzēš ar dzemdes kakla mežģījumiem, un nieru un smadzeņu audus ātri sadala un ātri sasaldē šķidrā slāpeklī.

Atsauces

[1]. Hermansons SB, et al. Jaunu LRRK2 inhibitoru skrīnings, izmantojot lieljaudas TR-FRET šūnu testu LRRK2 Ser935 Phosphorylation.PLoS One. 2012; 7 (8): e43580. Epub 2012 28. augusts.

[2]. Dengs, Ksianmings, et al. Parkinsona&# 39 slimības kināzes LRRK2 selektīvā inhibitora raksturojums. Nature Chemical Biology (2011), 7 (4), 203.-205.

[3]. Koshibu K, et al. Alternatīva LRRK2-IN-1 Parkinsona&# 39 farmakoloģiskajiem pētījumiem. Farmakoloģija. 2015; 96 (5–6): 240–7.

[4]. Weygant N, et al. Mazas molekulas kināzes inhibitors LRRK2-IN-1 demonstrē spēcīgu iedarbību pret kolorektālo un aizkuņģa dziedzera vēzi, inhibējot dubultkortīnam līdzīgu kināzi 1. Mol vēzis. 2014. gada 6. maijs; 13: 103