β-nikotinamīda mononukleotīda (NMN) veidošanās Escherichia coli

Kopsavilkums

Cukura diabēts ir hroniska un progresējoša slimība, kuras izplatība nepārtraukti pieaug, un pieaug finanšu spiediens uz pasaules veselības aprūpes sistēmām. Nesen izturība pret insulīnu, kas ir 2. tipa diabēta pazīme, tika izārstēta pelēm, kuras ārstēja ar NAD ⁺ prekursora β-nikotinamīda mononukleotīdu (NMN) , par toksiskām sekām netika ziņots. Tomēr NMN ir augsta cenu zīme, ir vajadzīgas rentablākas ražošanas metodes. Šis pētījums piedāvā biotehnoloģisko NMN ražošanas metodi Escherichia coli . Mēs parādām, ka rekombinantās nikotinamīda fosforibozil-transferāzes (Nampt) un fosforibosil-pirofosfāta (PRPP) sintetāzes bicistronic ekspresija nikotinamīda (NAM) un laktozes klātbūtnē var būt veiksmīga rentablas NMN ražošanas stratēģija. Olbaltumvielu ekspresijas vektori, kas satur NAMPT gēnu no Haemophilus ducreyi un PRPP sintetāzi no Bacillus amyloliquefaciens ar L135I mutāciju, tika pārveidoti Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Šajās šūnās, kuras audzēja PYA8 barotnē, kas papildināta ar 0,1% NAM un 1% laktozes, NMN produkcija sasniedza maksimāli 15,42 mg uz baktēriju kultūras L (vai 17,26 mg uz gramu olbaltumvielu).

Ievads

Saskaņā ar Starptautiskās Diabēta federācijas datiem pieaugušo skaits ar 2. tipa cukura diabētu 2017. gadā bija 425 miljoni, un paredzams, ka līdz 2045. gadam tas sasniegs 649 miljonus. Globālā mērogā tiek tērēti 12% no veselības aprūpes budžeta (jeb 727 miljardi USD). par diabēta ārstēšanu. Jaunākie pētījumi saistīja insulīna rezistenci, kas ir 2. tipa diabēta pazīme, ar mitohondriju funkcijas samazināšanos un NAD ⁺ līmeņa pazemināšanos, kā arī NAD ⁺ / NADH attiecību, ko novēro arī novecojot. NAD ⁺ ir sastopams visos dzīvos organismos un ir labi pazīstams koenzīms oksidācijas-reducēšanās reakcijās. No NAD ⁺ atkarīgi olbaltumvielu deacetilāzes, piemēram, SIRT1 un SIRT6, kalpo kā metabolisma sensori un regulē pakārtotos ceļus, kas galu galā atjauno mitohondriju funkcijas un jutīgumu pret insulīnu. Šis atradums paplašina NAD ⁺ ietekmes pētījumu jomu uz citām deģeneratīvām slimībām, kas saistītas ar novecošanos, piemēram: sirds un asinsvadu, vēzis, artrīts, osteoporoze vai Alcheimera slimības.

Β-nikotinamīda mononukleotīds (NMN) ir starpprodukts NAD ⁺ biosintēzē, ko no nikotinamīda (NAM) un fosforibosilpirofosfāta (PRPP) ražo nikotinamīda fosforibozil-transferāzes enzīms (Nampt) (EC 2.4.2.12). Būdams labi panesams un ilgstošām ievadīšanas reizēm pelēm neliecinot par blakusparādībām un novēršot ar vecumu saistītu fizioloģisku samazināšanos, NMN izrādījās efektīvs, lai ārstētu diētu ar paaugstinātu tauku saturu izraisītu 2. tipa cukura diabētu, novēršot mitohondriju funkcijas traucējumus, kas saistīti ar novecošanos, un glābjot ar vecumu saistīta nervu cilmes šūnu samazināšanās ietekme.

NAM parasti pārvērš NMN ar fermentiem, kas iesaistīti NAD ⁺ glābšanas ceļos, piemēram, Nampt. Šī fermenta darbība ir galvenā NAD ⁺ anaboliskā aktivitāte šūnā. Zīdītāju vai mikroorganismu nukleotīdu metabolisma un biosintēzes regulēšana parasti notiek, patērējot PRPP. PRPP rodas no ribozes-5-fosfāta gan pentozes fosfāta ceļa oksidējošajos, gan neoksidatīvajos zaros.

Baktērijās NAM ar nikotinamidāzi visbiežāk pārvērš nikotīnskābē (NA), kas ir integrēta Preiss-Handler ceļā, tas pats attiecas arī uz Escherichia col . Zīdītājiem par nikotinamidāzes aktivitāti netika ziņots; Tā vietā NAM tiek pārveidots par NMN, izmantojot vienu no NAM fosforibosiltransferāzes fermentiem. Lai arī lielākajai daļai baktēriju trūkst NAM fosforibosiltransferāzes, fermentu ekspresē Haemophilus ducreyi un Shewanella oneidensis .

Biotehnoloģijā bieži izmanto vienkāršus un metaboliski daudzveidīgus organismus, piemēram, Escherichia coli , lai kontrolētu olbaltumvielu ekspresiju ar vēlamo fermentatīvo aktivitāti. DNS, kas kodē šādus fermentus, baktērijās bieži ievada ar ekspresijas vektoriem, piemēram, pET sistēmu no Novagen. PET vektori tiek pārveidoti baktērijās, kas ekspresē T7 RNS polimerāzi, piemēram, E. coli BL21 (DE3). Fermentu ekspresijas kontrole tiek panākta, izmantojot lac promotoru, kas ekspresiju ieslēdz tikai laktozes (arī metabolizētas kā oglekļa avota) vai tās sintētiskā struktūras analoga, izopropil-1-tio-β-D-galaktopiranozīda (IPTG) klātbūtnē ( netiek metabolizēts, ar nemainīgu koncentrāciju audzēšanas procesā). Tā kā baktēriju metabolisms ir daudzpusīgs, oglekļa avota variācijas un vidēja līmeņa fermentu substrātu koncentrācija ir galvenie faktori, kas jāņem vērā biotehnoloģiskajā procesā.

Mērķis ir pievērsties pašreizējai augsto NMN cenu problēmai. Iepriekšējā darbā mēs ierosinājām attīrīšanas metodi no baktēriju šūnām. Turpmākai procesa optimizācijai, jo mums izdevās atrast tikai vienu publicētu rauga ražošanas metodi, šajā pētījumā ir ierosināta vienkārša un rentabla NMN biotehnoloģiskās ražošanas metode Escherichia coli .

Rezultāti

Baktēriju transformācija

Vairāku aminoskābju secību izlīdzināšana, kas radīta domājamam NadV no Haemophilus ducreyi, NadV , Shewanella oneidensis MR-1 un Nampt no Mus musculus , parāda augstu līdzību (Fig. S1), padarot visus šos fermentus kandidātus biotehnoloģiskajam procesam.

Pārveidots E. coli šūnas ar nadV (NAMPT) gēniem, ko pārvadā pET28a (+) plazmīdas, veidoja kolonijas LB Agara plāksnēs, kas papildinātas ar kanamicīnu. Plātnēs, kas inokulētas ar netransformatētām baktēriju šūnām, kolonijas netika atklātas. No šīm kolonijām izolētās plazmīdu DNS agarozes gela elektroforēze apstiprināja Nampt-PET28a, pET28a-soNadV vai pET28a-hdNadV plazmīdu klātbūtni E. coli DH5α (papildu S2A. att., 2., 3., 4. josla). DNS joslas sakrita ar joslām no E. coli BL21 (DE3) pLysS šūnas (papildu S2A. att., 6., 7., 8. josla), kuras tika pārveidotas ar atbilstošām plazmīdām, kas ekstrahētas tieši no E. coli DH5α. Nepārveidotā E. coli BL21 (DE3) pLysS šūnas, kuras tika izmantotas kā negatīvā kontrole, pLysS plazmidijas klātbūtne tika apstiprināta ar elektroforēzi, josla, kas atbilst zināmajam 4886 bp garumam (papildu S2A attēls, 5. josla), tika parādīta agarozes želejā.

(Lai iegūtu vairāk eksperimentālu datu, skatiet sākotnējo vietni: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)